Preguntas más frecuentes sobre la electroforesis en gel de agarosa

1. ¿Qué factores debo tener en cuenta al seleccionar el tipo de agarosa?

La aplicación determinará el tipo de agarosa más adecuado. Las técnicas de electroforesis en gel utilizan agarosas estándar, de bajo punto de fusión (Low Melting), de calidad genética certificada (GQT, Genetic Quality Tested) y agarosas de alta resolución (sieving agaroses). Estas últimas permiten separar fragmentos de ADN tanto grandes como pequeños y son ampliamente utilizadas en aplicaciones como Southern blot, clonación, técnicas de amplificación por PCR, entre otras.

2. ¿Qué concentración de agarosa debe utilizarse para preparar el gel?

Las concentraciones de agarosa más utilizadas para la separación de ácidos nucleicos se encuentran entre 0,5 % y 4 %(incluso tan bajas como 0,3 % si se utiliza agarosa D-5).
La concentración adecuada dependerá del tipo de agarosa y del tamaño de los fragmentos que se desean separar. Como regla general, cuanto más pequeños sean los fragmentos, mayor deberá ser la concentración de agarosa.

3. ¿Qué tampón debe utilizarse para optimizar la electroforesis en gel?

Los tampones TAE y TBE son los más utilizados. Ambos pueden emplearse con cualquier tipo de agarosa; sin embargo, presentan propiedades diferentes que los hacen más adecuados para distintas aplicaciones.
El tampón TAE 1X posee una baja fuerza iónica y una capacidad amortiguadora reducida, por lo que es necesario recircular la solución tampón cuando los tiempos de electroforesis son prolongados.
Por su parte, el tampón TBE 1X presenta una mayor fuerza iónica y una elevada capacidad amortiguadora, lo que permite realizar corridas de mayor duración. Además, se recomienda para la separación de fragmentos pequeños, especialmente cuando existen diferencias mínimas de tamaño entre ellos.
Por último, el tampón TAE 1X proporciona una mejor separación de fragmentos grandes de ADN.

4. ¿Qué tampón se recomienda para electroforesis analítica?

Pueden utilizarse tanto TAE (1X) como TBE (1X o 0,5X). El tampón TAE ofrece una mejor resolución para fragmentos grandes (> 10 kb), mientras que el TBE reduce la movilidad electroforética y proporciona una mejor resolución para fragmentos pequeños (< 1 kb).

5. ¿Qué tampón se recomienda para la electroforesis preparativa?

Cuando se pretende recuperar el ADN del gel para su manipulación posterior, se recomienda utilizar el tampón TAE. Si se emplea TBE, el borato presente en el tampón puede interactuar con los grupos hidroxilo del polisacárido de la agarosa, formando complejos que dificultan la recuperación del ADN.

6. ¿Es importante recircular el tampón durante electroforesis de larga duración?

La recirculación evita la formación de gradientes de pH y el agotamiento del tampón. Por ello, puede ser necesaria en electroforesis prolongadas (más de 5 horas) cuando se utiliza TAE, debido a su baja capacidad amortiguadora.

7. ¿Qué voltaje debe utilizarse para obtener condiciones adecuadas de electroforesis?

En electroforesis horizontal se recomienda aplicar entre 4 y 10 V/cm, medidos como la distancia entre el ánodo y el cátodo (no la longitud del gel).
Si el voltaje es demasiado bajo, la movilidad de las bandas disminuye y estas se ensanchan debido a la difusión. Si el voltaje es demasiado alto, la resolución disminuye, principalmente como consecuencia del sobrecalentamiento del gel.
Como regla general:
1–2 V/cm para fragmentos grandes (> 10 kb).
4–10 V/cm para fragmentos pequeños (< 1 kb).

8. Sometimes the bands appear wavy – What could be the cause?En ocasiones las bandas aparecen onduladas. ¿Cuál podría ser la causa?

La causa más frecuente es la presencia de restos de gel secos adheridos a los dientes del peine. Para evitarlo, el peine debe limpiarse cuidadosamente antes de su uso.
También es importante retirar el peine con cuidado para evitar arrastrar parte del gel. Se recomienda mantener el gel a 4 °C durante 30 minutos o sumergirlo previamente en el tampón antes de retirar el peine.

9. ¿Qué cantidad de ADN debe cargarse en cada pocillo?

La cantidad depende de la aplicación; sin embargo, lo más importante es la cantidad de ADN presente en las bandas de interés.
La cantidad mínima detectable mediante tinción con bromuro de etidio (EtBr) es de aproximadamente 10 ng. La cantidad de ADN que puede cargarse depende del volumen del pocillo, del tamaño de los fragmentos y de su distribución.
La cantidad máxima de ADN que puede contener una banda y seguir siendo nítida y bien definida es de aproximadamente 100 ng. Estos valores pueden variar si se emplea otro sistema de tinción.
Para determinar la cantidad óptima, se recomienda cargar varias muestras con diferentes cantidades de ADN.

10. ¿Cómo debe prepararse el gel para obtener la mejor resolución?

El espesor del gel es un factor importante; se recomienda utilizar un peine que produzca un gel de 3–4 mm de grosor.
El grosor de los dientes del peine también influye significativamente en la resolución. Un peine fino (1 mm) produce bandas más estrechas y mejor definidas, mientras que un peine grueso genera bandas más anchas, reduciendo la resolución.

11. ¿Qué método se recomienda para disolver la agarosa?

Cualquier método es adecuado. El procedimiento más rápido y práctico consiste en disolver la agarosa en un horno microondas.
Cuando se trabaja con concentraciones elevadas, donde la alta viscosidad y la formación de espuma dificultan la disolución, resulta más sencillo utilizar un baño de agua hirviendo.
Asimismo, la esterilización en autoclave constituye una excelente opción cuando se preparan soluciones de alta concentración o cuando se requiere una solución estéril.

12. ¿Cómo puede evitarse la formación de espuma durante la disolución?

Se recomienda hidratar el polvo de agarosa en el tampón durante 10–15 minutos antes de calentarlo para completar la disolución. Este tiempo de hidratación reduce la formación de espuma y facilita la disolución.
Al utilizar un horno microondas, es importante evitar el sobrecalentamiento de la agarosa. Si la potencia del microondas es elevada, puede minimizarse la formación de espuma calentando el matraz durante 1 minuto, retirándolo posteriormente para agitarlo suavemente y resuspender la agarosa sedimentada. A continuación, se vuelve a introducir en el microondas y se calienta durante otro minuto, o hasta lograr la disolución completa.